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酵母感受態細胞轉化失敗的原因一般有哪些

更新時間:2025-09-26      點擊次數:204
酵母感受態細胞是通過特殊處理(如化學或物理方法)使酵母細胞暫時具備吸收外源DNA能力的細胞,主要用于基因克隆、蛋白表達及酵母雙雜交等分子生物學實驗‌。
轉化成功的判斷標準:
‌菌落形態與數量‌:
成功轉化的酵母感受態細胞在選擇性培養基上應形成‌乳白色、圓形、直徑≥1mm的單菌落‌‌。
若菌落過小(<0.5mm)或呈彌散狀(一層菌膜),則可能為轉化失敗‌。
‌轉化效率驗證‌:
單質粒轉化效率通常需達到‌10³~10?cfu/μgDNA‌‌。
文庫轉化時,需在缺陷平板上獲得‌≥10?個轉化子‌(如10μL重懸液涂布后菌落數≥10個。
轉化失敗的常見原因及排查:
‌質粒問題‌:
電泳檢測質粒是否完整(條帶明亮、大小正確)‌。
檢查質粒是否攜帶正確的篩選標記‌。
‌培養基與操作問題‌:
確認選擇性培養基配制正確(如抗生素濃度、營養缺陷型補充)‌。
熱激條件需嚴格(30℃孵育30min+42℃熱激20min)‌。
‌細胞狀態異常‌:
鏡檢酵母細胞是否形態正常(卵圓形、無裂解)‌。
活細胞比例需高(可通過亞甲基藍染色法驗證,活細胞無色)‌。
 

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